Wpływ kompleksu substancji porostowych na wybrane grzyby glebowe

Abstract

Głównym celem przeprowadzonych eksperymentów było określenie wpływu wyekstrahowanego wodą deszczową kompleksu substancji porostowych na dynamikę wzrostu mycelium trzech wybranych przedstawicieli wielkoowocnikowych Basidiomycota – Armillaria borealis, Heterobasidion parviporum i Hebeloma crustuliniforme. W celu optymalizacji warunków doświadczalnych, przeprowadzono wstępne eksperymenty mające na celu określenie: (1) typu pożywki i temperatury hodowli kultur grzybowych, (2) użyteczności trocin drzewnych w hodowli izolatów A. borealis, (3) skutecznej metody ekstrakcji wodnej, czasu ekstrakcji i wpływu odczynu pH rozpuszczalnika w trzech wartościach – pH 3 (zakwaszany), pH naturalne i pH 9 (alkalizowany), (4) gatunków porostów, jako źródła różnorodnych substancji porostowych w hodowlach zasadniczych, (5) określenia dawki ekstraktu oraz czasu pomiędzy jego suplementowaniem a szczepieniem inokulatów grzybowych na podłożu hodowlanym. Finalnie, do dalszych eksperymentów wybrano sześć gatunków porostów epigeicznych, t.j.: Cetraria islandica, Cladonia arbuscula, C. mitis, C. digitata, C. rangiferina i C. uncialis oraz jeden gatunek epifityczny – Pseudevernia furfuracea, z których uzyskiwano ekstrakty jednogatunkowe oraz ekstrakty ze zmieszanych plech w dwóch zestawach: (1) Cladonia mitis + C. digitata + C. rangiferina i (2) Cetraria islandica + Cladonia mitis + C. digitata + C. rangiferina + C. uncialis. Ekstrakcji wodnych (w odczynie pH 9) w fazie finalnej eksperymentów dokonywano dwoma metodami: 1) metodą ogrzewanej żarówką kąpieli wodnej plech porostów, zwanej „metodą żarówkową” i 2) metodą gotowania plech porostów w kąpieli wodnej, zwanej „metodą herbacianą”. Przed założeniem właściwej hodowli kultur grzybowych in vitro wszystkie ekstrakty wodne z plech porostów suplementowano w dawkach 1 ml, 2 ml, 3 ml i 4 ml dwoma sposobami: 1) na powierzchnię zestalonej pożywki Hansena oraz 2) przez wymieszanie ich z pożywką. Uzyskiwane wyniki dynamiki wzrostu mycelium rejestrowano za pomocą Techniki Zatrutej Żywności (PFT). Przeprowadzono analizę chromatograficzną UPLC-PDA-ESI-MS ekstraktów, w celu określenia profilu chemicznego metabolitów wtórnych porostów, wpływających na wzrost kultur grzybowych testowanych trzech gatunków macromycetes. Rezultaty doświadczeń in vitro pokazały, że efektem „ekstrakcji żarówkowej”, która odzwierciedla w pewnym stopniu okoliczności możliwe do zaistnienia w warunkach naturalnych, jest uzyskanie takich stężeń kompleksów substancji porostowych, w tym metabolitów wtórnych, które częściej stymulują niż inhibują rozwój grzybni testowanych reprezentantów Basidiomycota. Hodowle zasuplementowane ekstraktami uzyskanymi „metodą herbacianą”, potwierdziły pro-witalne oddziaływanie kompleksu substancji porostowych, szczególnie wobec kultur A. borealis. Obserwowane efekty (stymulacja-inhibicja) były równocześnie zdeterminowane poziomem dyspersji wyekstrahowanych wodą substancji w podłożu hodowlanym. Większy potencjał ograniczający wzrost kultur Heterobasidium parviporum i Hebeloma crustuliniforme obserwowano w metodzie suplementacji ekstraktu do pożywki, podczas gdy kultury A. borealis rosły porównywalnie w obu sposobach suplementacji. Nie stwierdzono efektów grzybobójczych w żadnej z testowanych kombinacji. Reakcja grzybni na substancje porostowe jest efektem specyfiki gatunku, ale zależy również od zastosowanej metody ekstrakcji czy sposobu rozprowadzenia substancji porostowych – powierzchniowo na zestalonej pożywce lub wgłębnie. Ogólnie, największy potencjał stymulujący dynamikę wzrostu testowanych myceliów zmierzono w hodowlach z „wyciągiem żarówkowym” z plech Cetraria islandica, Cladonia arbuscula i C. uncialis, zaś najwyższy stopień ograniczenia dynamiki wzrostu grzybni miał miejsce w próbach z ekstraktem z plech Cladonia digitata i Pseudevernia furfuracea. Analogicznie, hodowle suplementowane „ekstraktem herbacianym”, w największym stopniu wzrastały w próbach z ekstraktem z plech Cetraria islandica, Cladonia rangiferina i C. digitata; najsłabszy rozrost grzybni zmierzono w wariantach z ekstraktem z plech Cladonia arbuscula, Pseudevernia furfuracea oraz – z nieco słabszym poziomem ograniczenia wzrostu mycelium – z plech C. uncialis. Ekstrakty ze zmieszanych plech epigeitów, podobnie jak wyciągi na bazie plech jednogatunkowych, wykazały podobne specyficzno-metodologiczne zależności oddziaływania na dynamikę wzrostu mycelium testowanych grzybów. Największe rozmiary grzybni hodowanych macromycetes w próbach dawkowanych ekstraktami wodnymi z plech porostów dochodziły do blisko 190% średnich dymensji grzybni w próbach kontrolnych, natomiast najwyższy poziom inhibicji ograniczył ich rozmiary do około 30% średnich dymensji kultur w próbach kontrolnych. W ujęciu ogólnym, najmniejszą amplitudę dynamiki wzrostu (największą oporność na potencjał kompleksu substancji porostowych) obserwowano dla izolatów H. crustuliniforme. Uzyskane wyniki doświadczeń w oparciu o „ekstrakcję żarówkową” wskazują na konieczność zmiany paradygmatu, mówiącego o allelopatycznej roli metabolitów wtórnych porostów w przyrodzie, jako substancji wyłącznie hamujących rozwój mikroorganizmów, w tym grzybów. Wyekstrahowane wodą pierwotne i wtórne metabolity porostowe (kompleks substancji), w stężeniach takich, jakie uzyskano w przeprowadzonych eksperymentach, wydają się oddziaływać w środowisku naturalnym bardziej jako stymulatory wzrostu mycelium glebowych grzybów wielkoowocnikowych – przynajmniej w świetle trzech poddanym eksperymentom gatunków. Ekstrakty uzyskane „metodą herbacianą” wydają się być nie tylko skutecznym, ale i bezpiecznym środkiem grzybostatycznym względem patogena Heterobasidium parviporum. Jednocześnie, przeciwko A. borealis, obiecujące wydają się być wyciągi wodne z plech P. furfuracea. Względem Hebeloma crustuliniforme przyszłościowe wydaje się zastosowanie niskich dawek substancji porostowych jako środków promikoryzowych. Opisane w niniejszej pracy wyniki przeprowadzonych eksperymentów stanowią obiecujący kierunek badań nad rolą i wykorzystaniem substancji porostowych ekstrahowanych wodą, na wielu płaszczyznach, włączając ekologiczną, fitofarmakologiczną, medyczną i gospodarczą.

The main objective of the experiments was to determine the effect of a rainwater-extracted complex of lichen substances on the growth dynamics of mycelia of three selected representatives ofthe Basidiomycota with large fruit bodies, namely Armillaria borealis, Heterobasidion parviporum and Hebeloma crustuliniforme. In order to optimize the experimental conditions, preliminary experiments were conducted to determine: (1) medium type and temperature of fungal culture incubation, (2) usefulness of wood sawdust in the A. borealis cultures, (3) effective water extraction method, duration time of extraction and effect of solvent pH at three pH values – pH 3 (acidified), normal pH and pH 9 (alkalified), (4) lichen species as a source of various lichen substances in main experiments, and (5) determination of extract dose and time between supplementation and inoculation of fungal isolates on medium. Finally, six epigeic lichen species were selected for further experiments, namely Cetraria islandica, Cladonia arbuscula, C. mitis, C. digitata, C. rangiferina and C. uncialis and one epiphytic species, Pseudevernia furfuracea, from which single species extracts and mixed lichen species extracts were obtained in two sets: (1) Cladonia mitis + C. digitata + C. rangiferina and (2) Cetraria islandica + Cladonia mitis + C. digitata + C. rangiferina + C. uncialis. Finally, water extractions from lichens were obtained at pH 9 by two methods: (1) in a bulb-heated water bath, referred to as the "bulb method" and (2) in a bath with boiling water, referred to as the "tea method". Prior to the establishment of the main in vitro fungal culture, all the water extracts from the lichen species were supplemented at 1 ml, 2 ml, 3 ml and 4 ml by two methods: 1) on the surface of solidified Hansen's medium and 2) by mixing extracts with the medium. The obtained results of mycelium growth dynamics were recorded using the Poisoned Food Technique (PFT). UPLC-PDA-ESI-MS chromatographic analysis of the extracts was performed to determine the chemical profile of lichen secondary metabolites affecting the growth of fungal cultures of the three species tested. The results of in vitro experiments showed that the effect of "bulb extraction", which partly reflects the conditions possible to occur in nature, allows to reach such concentrations of complexes of lichen substances, including secondary metabolites, which more often stimulate than inhibit the growth of mycelia tested representatives of fungi. Cultures supplemented with extracts obtained by the "tea method" confirmed the stimulation effect of lichen substance complexes, especially in the case of A. borealis cultures. The observed effects (stimulation-inhibition) were simultaneously determined by the level of dispersion of water-extracted substances in the medium. Higher growth-limiting potentials of H. parviporum and H. crustuliniforme cultures were observed in extract mixed with medium, while A. borealis cultures grew comparatively in both supplementation methods. No fungicidal effects were observed in any of the combinations tested. The reaction of the mycelium to lichen substances is a result of species specificity, but it also depends on the extraction method used or the method of distribution of lichen substances – on the surface of solidified medium or mixed within medium. In general, the highest potential to stimulate the growth dynamics of tested mycelia was measured in cultures with "bulb extract" from lichens of Cetraria islandica, Cladonia arbuscula and C. uncialis, while the highest reduction of mycelial growth dynamics was observed in samples with the extracts obtained by Cladonia digitata and Pseudevernia furfuracea. Similarly, cultures supplemented with "tea extract" grew to the greatest extent in samples with extracts from Cetraria islandica, Cladonia rangiferina and C. digitata; the weakest mycelial growth was measured in variants with extracts from Cladonia arbuscula, Pseudevernia furfuracea, and - with a slightly weaker level of mycelial growth inhibition - from C. uncialis. The extracts obtained from mixed-lichen epigeic species were similar to those based on single species in that they showed specific-methodological dependencies of impact upon mycelium growth dynamics. The largest mycelial dimensions of cultured fungi in samples supplemented with water extracts reached almost 190% of the mean mycelial diameter in control samples, while the highest level of inhibition was c. 30% of the mean diameter of the cultures in control samples. Overall, the lowest amplitude of growth dynamics (highest resistance to the potential of the lichen substance complex) was observed for H. crustuliniforme isolates. The results obtained from experiments based on "bulb extraction” indicate the necessity of changing the paradigm, to reflect the allelopathic role of lichen secondary metabolites in nature, as substances exclusively inhibiting the growth of microorganisms, including fungi. Water-extracted primary and secondary lichen metabolites (substance complex), in such concentrations as those obtained in the conducted experiments, seem to influence in the natural environment much more as stimulators of mycelium growth of soil macrofungi – at least in the light of the three tested species. Extracts obtained by the "tea method" seem to be effective and safe fungistatic (in an inhibitory sense) agents against the pathogen H. parviporum. Simirly, against A. borealis, water extracts from the thalli of P. furfuracea seem to be promising. In terms of H. crustuliniforme, the use of low doses of lichen water-extracted substances as pro-mycorrhizal agents should be effective. The results of the experiments described in this work establish a suitable basis for future research on the role and use of water-extracted lichen substances in a wide variety of fields, including those of an ecological, phytopharmacological, medical and economic nature.