Wpływ tlenku węgla na ekspresję genów gonadotropin i gonadoliberyny w centralnym układzie nerwowym świniodzika w okresie lata i zimy

Abstract

Badanie biologicznego fenomenu sezonowej reprodukcji i mechanizmów leżących u jego podstaw obejmuje wiele zagadnień. Wśród nich znajdują się: identyfikacja czynników środowiskowych, które regulują te procesy oraz próby wyjaśnienia neurobiologicznej drogi odbierania i przetwarzania sygnałów środowiskowych. Fotoperiod jest głównym i najbardziej wiarygodnym czynnikiem synchronizującym roczne cykle reprodukcyjne sezonowo rozmnażających się zwierząt. Mechanizmy tej regulacji nie są do końca poznane. Dotychczasowe badania wskazują, że w fotoperiodycznej synchronizacji aktywności rozrodczej bierze udział nie jeden a co najmniej kilka systemów regulacyjnych, które mają swój początek w siatkówce oka i kończą się w generatorze pulsów GnRH. Badania przeprowadzone w ramach niniejszej pracy są następstwem wykazania sezonowej zmienności sekrecji CO w obszarze oka i mają za cel określenie drogą pośrednią czy tlenek węgla drogą przeciwprądowego przenikania w obszarze zatoki jamistej może bezpośrednio docierać do struktur mózgowych i wpływać na regulacje fizjologiczne u samców związane z rozrodem. Do doświadczeń użyto 48 dojrzałych płciowo samców krzyżówki dzika europejskiego i świni domowej. Zwierzęta zostały przydzielone do dwóch analogicznych grup doświadczalnych. W doświadczeniu pierwszym prowadzono 48-godzinną infuzję do zatoki żylnej oka autologicznego osocza krwi o doświadczalnie podwyższonym stężeniu tlenku węgla. Taka sama procedura eksperymentalna została przeprowadzona na osobnych grupach zwierząt w okresie długich (czerwiec n=6) oraz krótkich (grudzień n=6) dni świetlnych. Odniesieniem do obu grup eksperymentalnych były prowadzone równolegle kontrolne grupy zwierząt (czerwiec n=6; grudzień n=6), którym w tych samych warunkach do zatoki żylnej oka przez 48 godzin infundowano autologiczne osocze. W doświadczeniu drugim prowadzono 48-godzinną infuzję do zatoki żylnej oka autologicznej krwi poddanej naświetlaniu światłem LED. Taka sama procedura eksperymentalna została przeprowadzona na osobnych grupach zwierząt w okresie długich (czerwiec; n=6) oraz krótkich (grudzień; n=6) dni świetlnych. Odniesieniem do obu grup eksperymentalnych były prowadzone równolegle kontrolne grupy zwierząt (czerwiec n=6; grudzień n=6), którym w tych samych warunkach do zatoki żylnej oka przez 48 godzin infundowano autologiczną krew. W każdej grupie doświadczalnej, w trakcie 48-godzinnej infuzji, od zwierząt w odstępach 2-godzinnych pobierano krew krążenia obwodowego do analiz stężenia hormonu luteotropowego, folikulotropowego oraz melatoniny. Po zakończeniu części eksperymentalnej w celu analizy ekspresji genów gonadoliberyny (GnRH), jej receptora (GnRH-R) oraz podjednostek gonadotropin (α, Lhβ, Fshβ) od zwierząt, poubojowo, pobierano przysadkę mózgową oraz podwzgórze. Tkanki zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80ºC do momentu wykonania analizy ekspresji genów. Stężenie hormonów w żylnej krwi obwodowej oznaczano metodą radioimmunologiczną. Ekspresję genów gonadoliberyny (GnRH), jej receptora (GnRH-R) oraz podjednostek gonadotropin (α, Lhβ, Fshβ) w tkankach podwzgórza oraz przysadki mózgowej oznaczono metodą Real-Time PCR. Wyniki badań wykazały, że doświadczalne zwiększenie stężenia CO we krwi żylnej odpływającej z oka do żylnej zatoki jamistej okołoprzysadkowego kompleksu naczyniowego u obu grup doświadczalnych samców krzyżówek świni domowej i dzika, spowodowało zarówno w okresie krótkich jak i długich dni świetlnych zmiany w poziomie ekspresji genów osi podwzgórzowo-przysadkowej (GnRH, GnRH-R, α, Lhβ, Fshβ). Jednocześnie wykazano wzrost sekrecji LH w sezonie letnim i jej obniżenie w sezonie zimowym. Zwiększenie stężenia CO w krwi odpływającej z zatoki ocznej istotnie wpłynęło również na dobowy profil sekrecji melatoniny. Podsumowując, wyniki badań przeprowadzonych w ramach niniejszej pracy wskazują, że tlenek węgla wytwarzany pod wpływem światła w oku dociera drogą przeciwprądowego przenikania w obszarze splotu okołoprzysadkowego z naczyń żylnych do tętniczych zaopatrujących bezpośrednio mózg i wpływa na ekspresję genów osi podwzgórzowo-przysadkowej krzyżówki świni domowej i dzika a w konsekwencji na sekrecję hormonów regulujących procesy rozrodcze.

Investigation into the biological phenomenon of seasonal reproduction, and its underlying regulatory mechanisms has focused on a wide variety of topics. These include identification of environmental cues which regulate the process and elucidation of the neurobiological pathway for perception and processing of these environmental cues. Photoperiod is the most reliable cue for timing reproduction in seasonal breeding animals. The mechanisms in this regulation are not well understood. Previous studies indicate that in photoperiodic synchronization of the reproductive activity there are involved at least a few regulatory systems, which start with the retina and end at the GnRH pulse generator. This work is the next step of previous research which shown that the secretion of CO in the eye into the ophthalmic venous blood of the wild boar and pig crossbreed changes depending on season. The aim of this work is to determine by indirect way whether carbon monoxide by counter-current exchange in the perihypophyseal vascular complex may be destination transported to the brain and influence the neural centers of the brain regulating the reproductive processes. 48 sexually mature wild boar and domestic pig crossebred males were used. The experimental animals were assigned to two treatment groups: In the first experiment the animals received autologous blood plasma infused into the ophthalmic venous sinus for 48 hours with an experimentally induced increase in CO concentration. The identical procedure was performed during the longest days of summer (n=6) and during the shortest days of winter (n=6). Control groups (June n=6; December n=6) received autologous blood plasma infused into the ophthalmic venous sinus for 48 hours. In the second experiment the animals received autologous blood infused into the ophthalmic venous sinus for 48 hours with an experimentally induced increase in the CO concentration, achieved by two-hour irradiation by LED light. The identical procedure was performed during the longest days of summer (n=6) and during the shortest days of winter (n=6). Control groups (June n=6; December n=6) received autologous blood infused into the ophthalmic venous sinus for 48 hours. All animals were sampled at 2-hr intervals for 48 hr for LH, FSH and melatonin content in peripheral blood. In order to analyze the effect of CO on GnRH and GnRH-R mRNA and gonadotropin subunits (α, Lhβ, Fshβ) mRNA levels, animals in each group were sacrificed after 48h infusion with the experimentally induced increase of concentration of CO. The hypothalamus and pituitary gland were immediately removed, frozen in liquid nitrogen and stored at -80oC until analysis of gene expression. The peripheral blood samples were used to determine the concentration of hormones using the radioimmunological method. The GnRH and GnRH-R mRNA and gonadotropin subunits (α, Lhβ, Fshβ) mRNA levels were determined by Real-Time quantitative PCR. The elevated CO concentration in the blood flowing out of the ophthalmic venous sinus in both experimental groups of males of the wild boar and domestic pig crossbred led to changes in the expression of hypothalamo-pituitary axis genes (GnRH, GnRH-R and gonadotropin subunits: α, Lhβ and Fshβ) during long and short days. There was shown increase in LH secretion in the summer and decrease in LH secretion in the winter. The elevated CO concentration in the blood flowing out of the ophthalmic venous sinus had significant affect on melatonin secretion circadian profile. To sum up, the results of this study show that light-induced carbon monoxide produced in the eye may be transported in the venous blood and transferred, by counter-current mechanism, to the arterial blood in the perihypophyseal vascular complex and then carbon monoxide can influence the neural centers of the brain regulating the reproductive processes.