Konstruowanie szczepów drożdży Hansenula polymorpha z ulepszonymi charakterystykami alkoholowej fermentacji ksylozy

Abstract

Obecnie zwiększa się zainteresowanie wykorzystywaniem biomasy jako niewyczerpalnego źródła paliw odnawialnych. W fabrykach pilotażowych, fermentację cukrów pochodzących z surowych materiałów prowadzi się z wykorzystaniem drożdży Saccharomyces cerevisieae. Jednak negatywną cechą tych mikroorganizmów jest ich naturalna zdolność do fermentacji jedynie heksoz. Dlatego też, celem niniejszej rozprawy było skonstruowanie szczepów drożdży Hansenula polymorpha zdolnych do zwiększonej produkcji etanolu z ksylozy (pentozy). Pierwszym etapem badań była nadekspresja genów związanych z metabolizmem ksylozy, a więc genów XYL1m, XYL2, XYL3 oraz PDC1 kodujących kolejno zmodyfikowaną reduktazę ksylozy, dehydrogenazę ksylitolu, kinazę ksylulozy oraz dekardoksylazę pirogronianową. Po wprowadzeniu powyższych modyfikacji najlepszy producent etanolu z ksylozy produkował ok. 7,5 g/L z ksylozy. Kolejnym etapem była selekcja, szczepów, otrzymanych na wcześniejszym etapie prac, opornych na kwas 3-bromopirogronianowy (3BrPA). Maksymalna ilość etanolu produkowanego z ksylozy przez szczepy otrzymane po selekcji na 3-BrPA to ok. 10 g/L w temp. 45°C. Następnie zdecydowano się na delecję genu CAT8, będącego globalnym czynnikiem transkrypcji, odpowiedzialnym za transkrypcję genów związanych z glukoneogenezą u drożdży S. cerevisiae. Zarówno delecyjny szczep wyizolowany w tle szczepu dzikiego jak i szczepu o już zwiększonej produkcji etanolu, charakteryzowały się zwiększoną produkcją etanolu z ksylozy, wartości te wynosiły 0,78 g/L (dla szczepu NCYC/ΔCAT8) oraz 12,5 g/L (dla szczepu 2EtOH/XYL1m/XYL2/XYL3/BrPA/ΔCAT8).

Currently is increasing interest for the use of natural feedstock, including biomass, as an almost inexhaustible source of renewable fuels. Pilot plants for fuel ethanol production from lignocelluloses uses baker’s yeast Saccharomyces cerevisieae. However it has severe defects as ferments only hexoses and do not possess ability to metabolize varieties of biomass pentoses. Therefore the aim of this work was the construction of the strains of the yeast H. polymorpha accumulating elevated amounts of ethanol from xylose under elevated temperatures. The first step was the overexression of XYL1m, XYL2, XYL3 and PDC1 genes encoding engineered xylose reductase, xylitol dehydrogenase, xylulokinase and pyruvate decarboxylase. As the parental strain for construction, the mutant 2EthOH- which is characterized by elevated ethanol production from xylose, was used. Introduction of the mentioned modifications led to strains accumulated near 7,5 g of ethanol/L from xylose. The next step of our work was selection of the strain obtained on the medium with 3-bromopyruvate (3BrPA). Maximal amount of ethanol accumulated by 3-BrPA-resistant strains was 10 g/ L under 45°C. We continued to search for approaches which would improve ethanol production from most abundant pentose sugar of lignocellulose. We hypothesized that knock out of CAT8 gene, ortholog of S. cerevisiae global transcription regulator responsible for transcription of gluconeogenic genes, will activate xylose alcoholic fermentation. The corresponding deletants were characterized by elevated ethanol production from xylose: 0,78 g/L (for the strain NCYC/ΔCAT8) and 12,5 g/L (for the strain 2EtOH/XYL1m/XYL2/XYL3/BrPA/ΔCAT8).