Wpływ dendrymerów PAMAM oraz ich biokoniugatów z biotyną i pirydoksalem na właściwości biologiczne różnych typów komórek in vitro

Abstract

Dendrymery znajdują coraz szersze zastosowanie zarówno w dziedzinie nauk medycznych (diagnostyka, terapia) jak i w przemyśle farmaceutycznym, głównie jako nośniki leków, genów i innych substancji biologicznie aktywnych. Wśród różnych typów dendrymerów wiele badań dotyczy kationowych dendrymerów typu poli(amidoaminowego) (PAMAM), których zastosowanie w biologii i medycynie związane jest z ich relatywnie niską cytotoksycznością oraz zdolnością do przenikania przez błony biologiczne. Wyzwaniem dla badaczy pozostaje ciągle optymalizacja układu wielofunkcyjnego nośnika w odniesieniu do różnego rodzaju komórek i tkanek. Taki cel wymaga interdyscyplinarnych badań na specyficznych modelach komórkowych. Wstęp zawiera informacje dotyczące właściwości i syntezy dendrymerów oraz przykłady zastosowania w różnych dziedzinach nauk biomedycznych, a także ich oddziaływanie z układem immunologicznym człowieka. Omówione zostały również właściwości witamin z grupy B (biotyny i pirydoksalu) oraz budowa i funkcje skóry ze szczególnym uwzględnieniem trzech badanych fenotypów komórek: fibroblastów, keratynocytów oraz raka płaskonabłonkowego. Przedmiotem rozprawy było zbadanie i porównanie wpływu natywnych kationowych dendrymerów PAMAM generacji 3 zawierających 32 terminalne grupy aminowe oraz ich biokoniugatu BC-PAMAM zmodyfikowanego witaminami grupy B (9 cząsteczkami biotyny i 10 cząsteczkami pirydoksalu) na trzech fenotypach ludzkich linii komórkowych skóry: normalnych fibroblastach BJ, komórkach raka płaskonabłonkowego SCC-15 oraz unieśmiertelnionych keratynocytach HaCaT. Zbadano cytotoksyczność dendrymerów po 24 godzinach inkubacji (test z czerwienią neutralną NR i solami tetrazolowymi XTT), ich wpływ na indukcję apoptozy (PARP-1) oraz migrację komórek (test gojenia ran). Przeprowadzone testy wykazały, że podstawienie dendrymerów dwiema różnymi biologicznie czynnymi substancjami: biotyną i pirydoksalem zmniejsza ich cytotoksyczność 5-10 razy (5-10 µM wobec 50 µM) we wszystkich badanych liniach. Normalne ludzkie fibroblasty są najbardziej wrażliwe na proapoptyczne działanie dendrymerów zarówno PAMAM, jak i BC-PAMAM, natomiast linia keratynocytów HaCaT wykazuje największą odporność na ich działanie. Oba rodzaje dendrymerów hamują ruchliwość komórek w stężeniach cytotoksycznych. Godna uwagi jest zaś stymulacja ruchliwości fibroblastów w niskim (1μM) stężeniu BCPAMAM. Przeprowadzono również ocenę wewnątrzkomórkowej akumulacji obu typów dendrymerów oraz ich kolokalizację w jądrach komórkowych i mitochondriach z zastosowaniem mikroskopu konfokalnego. Wewnątrzkomórkowa akumulacja obu dendrymerów zwiększała się wraz ze wzrostem ich stężenia, przy czym w przypadku linii BJ oraz SCC-15 szybszy wzrost akumulacji zanotowano do nietoksycznego 2,5 μM stężenia. Ponadto komórki fibroblastów i raka płaskonabłonkowego wykazywały w sposób istotny większą internalizację PAMAM niż BC-PAMAM. Biokoniugaty były nagromadzane w dużo mniejszej ilości we wszystkich liniach komórkowych w porównaniu do natywnego dendrymeru. Nagromadzenie dendrymerów w jądrach komórek było bardzo zróżnicowane. Największy sygnał obserwowano dla PAMAM w jądrach komórek fibroblastów, a stopień nagromadzania był wprost proporcjonalny do stężenia. Mniejszą akumulację wykazywały komórki SCC-15 przy braku zależności od stężenia, a najmniejszą HaCaT za wyjątkiem cytotoksycznego stężenia PAMAM. We wszystkich liniach komórkowych akumulacja BC-PAMAM w jądrze była istotnie niższa od natywnego dendrymeru. Kolokalizacja sygnału obu typów dendrymerów z mitochondriami wykazała interesujące ilościowe i jakościowe różnice. Najwyższy sygnał pochodził od PAMAM w fibroblastach, w sposób proporcjonalny do stężenia, podczas gdy najniższy obserwowano w HaCaT. Natomiast w komórkach rakowych obserwowano pośrednią wartość akumunlacji sygnału, ale w sposób niezależny od stężenia. We wszystkich badanych przypadkach akumulacja BC-PAMAM była znacząco mniejsza. Badania wpływu dendrymerów PAMAM i BC-PAMAM na prozapalną odpowiedź komórek linii HaCaT potwierdziły ogólnie ich przeciwzapalne właściwości. Wykazano hamowanie endogennej produkcji IL-1α przez PAMAM i BC-PAMAM w niecytotoksycznych stężeniach (1 μM), oraz obniżenie produkcji tej cytokiny w komórkach HaCaT stymulowanych bakteryjnymi czynnikami LPS i GroEL. Podsumowując, wykazano zróżnicowaną odpowiedź trzech fenotypów linii komórkowych ludzkiej skóry na działanie zarówno natywnych dendrymerów PAMAM G3 jak i ich koniugatu z biotyną i pirydoksalem, przy znacznie mniejszej cytotoksyczności biokoniugatu. Potwierdzono przeciwzapalne działanie obu typów dendrymerów w ich niecytotoksycznych stężeniach w keratynocytach HaCaT. Uzyskane wyniki nie potwierdzają obserwacji innych autorów, że biotyna zwiększa wejście dendrymerów do wszystkich typów komórek nowotworowych, wskazując na znaczenie dokładnego badania poszczególnych linii komórkowych.

Dendrimers are increasingly used in the field of medical science (diagnostics, therapy) as well as in the pharmaceutical industry, mainly as carriers of drugs, genes and other biologically active substances. Cationic poly(amidoamine) dendrimers (PAMAM) belong to the actively investigated group of dendritic polymers, since their use in biology and medicine is associated with relatively low cytotoxicity and the ability to penetrate biological membranes. As the aim for researchers remain the optimization of multifunctional carrier structure for various phenotype of cells and tissues. Such a target requires interdisciplinary investigations with specific cellular models Introduction contains information on the properties and synthesis of dendrimers and examples of applications in various fields of biomedical sciences, as well as their interaction with the human immune system. The properties of B vitamins (biotin and pyridoxal) and the structure and function of the skin, with particular emphasis on the three phenotypes of cells examined: fibroblasts, keratinocytes and squamous cell carcinoma, was also discussed. The aim of the dissertation was to investigate and compare the effect of native cationic generation 3 PAMAM dendrimers terminated with 32 amino groups and their BC-PAMAM bioconjugate modified with vitamins from group B (9 biotin and 10 pyridoxal molecules) on three phenotypes of human skin cell lines: normal fibroblasts BJ, cancer cells squamous SCC-15 and immortalized keratinocytes HaCaT. The cytotoxicity of dendrimers, after 24 hours incubation (neutral red assay NR and XTT tetrazolium salt assay), their effect on induction of apoptosis (PARP-1 estimation) and cell migration (wound healing assay) were evaluated. The tests has shown that substitution of dendrimers with two biologically active molecules: biotin and pyridoxal reduces their cytotoxicity 5-10 times (5-10 µM against 50 µM) in all investigated cell lines. Normal human fibroblasts are most sensitive against induction of apoptosis, whereas the HaCaT keratinocytes revealed high resistance towards both PAMAM and BC-PAMAM. Both types of dendrimers inhibit cellular motility at cytotoxic concentrations. Interesting is the stimulation of fibroblast motility at a low (1μM) concentration of BC-PAMAM. The intracellular accumulation and colocalization of both types of dendrimers in cell nuclei and mitochondria was performed by confocal microscopy. Intracellular accumulation of both dendrimers was concentration dependend, with BJ and SCC-15 faster increasing accumulation to non-toxic 2,5 μM concentration. In addition, fibroblast and squamous cell carcinoma showed significantly higher internalization of PAMAM than BCPAMAM. Bioconjugates were accumulated in a much smaller amount in all cell lines compared to the native dendrimer. The accumulation of dendrimers in the nuclei of cells was differentiated. The highest and concentration dependent signal was observed for PAMAM in fibroblasts. Lower and concentration independent accumulation was demonstrated by SCC-15 cells and the lowest accumulation of HaCaT except for high, cytotoxic of PAMAM concentration. The accumulation of BC-PAMAM in the nuclei was significantly lower than the native dendrimer in all cell lines. The colocalization signal of both types of dendrimers with mitochondria showed interesting quantitative and qualitative differences. The highest signal was from PAMAM was in fibroblasts, depending on concentration, while the lowest was observed in HaCaT. In contrast, an intermediate value of the signal accumulation in cancer cells was observed, but in a concentration-independent manner. An accumulation of BC-PAMAM was significantly lower in all cell lines. Investigations of PAMAM and BC-PAMAM effects on inflammatory response of HaCaT cells have generally confirmed their anti-inflammatory properties. Inhibition of endogenous level of cytokine IL-1α by both dendrimer types at non-cytotoxic concentrations (1 μM), as well as in HaCaT cells stimulated with bacterial pro-inflammatory factors LPS and GroEL was shown. In conclusion, marked difference was revealed concerning the response of three lines of various human skin cell line phenotypes towards effects of native PAMAM G3 dendrimer and its bioconjugate with biotin and pyridoxal, with significant lower cytotoxicity of conjugate. The antiinflammatory action of both dendrimer type in noncytotoxic concentration in HaCaT cells was confirmed. However, presented results did not confirm other authors observations that biotin increases dendrimers internalization in all cancer cell lines, indicating the importance of precise investigations of individual cell lines.