Przeglądanie według Temat "badania in vitro"

Aktualnie wyświetlane 1 - 1 z 1

Wpływ dendrymerów PAMAM oraz ich biokoniugatów z biotyną i pirydoksalem na właściwości biologiczne różnych typów komórek in vitro
(Uniwersytet Rzeszowski, 2018-07-12) Szuster, Magdalena
Dendrymery znajdują coraz szersze zastosowanie zarówno w dziedzinie nauk medycznych (diagnostyka, terapia) jak i w przemyśle farmaceutycznym, głównie jako nośniki leków, genów i innych substancji biologicznie aktywnych. Wśród różnych typów dendrymerów wiele badań dotyczy kationowych dendrymerów typu poli(amidoaminowego) (PAMAM), których zastosowanie w biologii i medycynie związane jest z ich relatywnie niską cytotoksycznością oraz zdolnością do przenikania przez błony biologiczne. Wyzwaniem dla badaczy pozostaje ciągle optymalizacja układu wielofunkcyjnego nośnika w odniesieniu do różnego rodzaju komórek i tkanek. Taki cel wymaga interdyscyplinarnych badań na specyficznych modelach komórkowych. Wstęp zawiera informacje dotyczące właściwości i syntezy dendrymerów oraz przykłady zastosowania w różnych dziedzinach nauk biomedycznych, a także ich oddziaływanie z układem immunologicznym człowieka. Omówione zostały również właściwości witamin z grupy B (biotyny i pirydoksalu) oraz budowa i funkcje skóry ze szczególnym uwzględnieniem trzech badanych fenotypów komórek: fibroblastów, keratynocytów oraz raka płaskonabłonkowego. Przedmiotem rozprawy było zbadanie i porównanie wpływu natywnych kationowych dendrymerów PAMAM generacji 3 zawierających 32 terminalne grupy aminowe oraz ich biokoniugatu BC-PAMAM zmodyfikowanego witaminami grupy B (9 cząsteczkami biotyny i 10 cząsteczkami pirydoksalu) na trzech fenotypach ludzkich linii komórkowych skóry: normalnych fibroblastach BJ, komórkach raka płaskonabłonkowego SCC-15 oraz unieśmiertelnionych keratynocytach HaCaT. Zbadano cytotoksyczność dendrymerów po 24 godzinach inkubacji (test z czerwienią neutralną NR i solami tetrazolowymi XTT), ich wpływ na indukcję apoptozy (PARP-1) oraz migrację komórek (test gojenia ran). Przeprowadzone testy wykazały, że podstawienie dendrymerów dwiema różnymi biologicznie czynnymi substancjami: biotyną i pirydoksalem zmniejsza ich cytotoksyczność 5-10 razy (5-10 µM wobec 50 µM) we wszystkich badanych liniach. Normalne ludzkie fibroblasty są najbardziej wrażliwe na proapoptyczne działanie dendrymerów zarówno PAMAM, jak i BC-PAMAM, natomiast linia keratynocytów HaCaT wykazuje największą odporność na ich działanie. Oba rodzaje dendrymerów hamują ruchliwość komórek w stężeniach cytotoksycznych. Godna uwagi jest zaś stymulacja ruchliwości fibroblastów w niskim (1μM) stężeniu BCPAMAM. Przeprowadzono również ocenę wewnątrzkomórkowej akumulacji obu typów dendrymerów oraz ich kolokalizację w jądrach komórkowych i mitochondriach z zastosowaniem mikroskopu konfokalnego. Wewnątrzkomórkowa akumulacja obu dendrymerów zwiększała się wraz ze wzrostem ich stężenia, przy czym w przypadku linii BJ oraz SCC-15 szybszy wzrost akumulacji zanotowano do nietoksycznego 2,5 μM stężenia. Ponadto komórki fibroblastów i raka płaskonabłonkowego wykazywały w sposób istotny większą internalizację PAMAM niż BC-PAMAM. Biokoniugaty były nagromadzane w dużo mniejszej ilości we wszystkich liniach komórkowych w porównaniu do natywnego dendrymeru. Nagromadzenie dendrymerów w jądrach komórek było bardzo zróżnicowane. Największy sygnał obserwowano dla PAMAM w jądrach komórek fibroblastów, a stopień nagromadzania był wprost proporcjonalny do stężenia. Mniejszą akumulację wykazywały komórki SCC-15 przy braku zależności od stężenia, a najmniejszą HaCaT za wyjątkiem cytotoksycznego stężenia PAMAM. We wszystkich liniach komórkowych akumulacja BC-PAMAM w jądrze była istotnie niższa od natywnego dendrymeru. Kolokalizacja sygnału obu typów dendrymerów z mitochondriami wykazała interesujące ilościowe i jakościowe różnice. Najwyższy sygnał pochodził od PAMAM w fibroblastach, w sposób proporcjonalny do stężenia, podczas gdy najniższy obserwowano w HaCaT. Natomiast w komórkach rakowych obserwowano pośrednią wartość akumunlacji sygnału, ale w sposób niezależny od stężenia. We wszystkich badanych przypadkach akumulacja BC-PAMAM była znacząco mniejsza. Badania wpływu dendrymerów PAMAM i BC-PAMAM na prozapalną odpowiedź komórek linii HaCaT potwierdziły ogólnie ich przeciwzapalne właściwości. Wykazano hamowanie endogennej produkcji IL-1α przez PAMAM i BC-PAMAM w niecytotoksycznych stężeniach (1 μM), oraz obniżenie produkcji tej cytokiny w komórkach HaCaT stymulowanych bakteryjnymi czynnikami LPS i GroEL. Podsumowując, wykazano zróżnicowaną odpowiedź trzech fenotypów linii komórkowych ludzkiej skóry na działanie zarówno natywnych dendrymerów PAMAM G3 jak i ich koniugatu z biotyną i pirydoksalem, przy znacznie mniejszej cytotoksyczności biokoniugatu. Potwierdzono przeciwzapalne działanie obu typów dendrymerów w ich niecytotoksycznych stężeniach w keratynocytach HaCaT. Uzyskane wyniki nie potwierdzają obserwacji innych autorów, że biotyna zwiększa wejście dendrymerów do wszystkich typów komórek nowotworowych, wskazując na znaczenie dokładnego badania poszczególnych linii komórkowych.