Rola tempa wzrostu objętości komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae w determinowaniu ich potencjału replikacyjnego i długości życia

Obrazek miniatury
Data
2014-07-07
Autorzy
Mołoń, Mateusz
Tytuł czasopisma
ISSN
Tytuł tomu
Wydawnictwo
Abstrakt
Drożdże Saccharomyces cerevisiae są jednym z organizmów modelowych dla badań procesu starzenia. Pomimo wielu specyficznych dla tej grupy cech, jak np. obecność ściany komórkowej, zamknięta mitoza, pączkowanie jako mechanizm cytokinezy, stanowią model dla badania uniwersalnych mechanizmów tego procesu. Jednym z modeli, którym posługuje się gerontologia drożdży jest, tzw. starzenie replikacyjne (RLS- Replicatve Life Span). Założono, że badając wpływ rożnych czynników na wartość RLS można będzie wyjaśnić podstawowe mechanizmy starzenia i długowieczności człowieka i zwierząt. Badanie polega na fizycznym oddzielaniu komórki córki, od komórki "matki", i zliczaniu wytworzonych córek, wykorzystując do tego celu technikę mikromanipulacji. Miarą wieku i długowieczności komórek drożdży jest liczba komórek potomnych jakie jest w stanie wytworzyć komórka "matka" w ciągu swojego życia. Taki sposób wyrażania wieku w ogóle nie uwzględnia czasu życia komórek. Dlatego też w miejsce terminu "replikacyjne starzenie" wprowadzono pojęcie potencjał reprodukcyjny. Termin ten lepiej odzwierciedla istotę badań, jak również dopuszcza inną przyczynę ograniczonej zdolności reprodukcyjnej komórek drożdży niż proces starzenia. Celem badań była analiza zmian wielkości komórek w czasie reprodukcyjnej fazy życia, analiza potencjału reprodukcyjnego oraz czasu życia komórek wybranych mutantów należących do grupy "długowiecznych". Biorąc pod uwagę, że fenotypowy efekt mutacji często wykazuje zależność od tła genetycznego, do analizy wykorzystano komórki drożdży reprezentujące trzy różne tła genetyczne tj. SP-4, BY4741 i BMA64-1A. Szczepy dzikie reprezentujące poszczególne tła genetyczne różnią się zarówno średnią jak i maksymalną wartością potencjału reprodukcyjnego, co może mieć wpływ na fenotypowe wyrażenie badanych mutacji. Do analizy wybrano trzy geny: FOB1, SCH9, RPL20B, których delecja prowadzi, według danych literaturowych, do zwiększenia potencjału reprodukcyjnego. Dodatkowo użyto mutanta delecyjnego sfp1 , opisywanego w literaturze jako "krótko żyjący". Uzyskane wyniki dotyczące potencjału reprodukcyjnego wskazują, że efekt fenotypowy dla większości mutantów nie jest jednakowy i wykazuje ścisłą zależność od tła genetycznego. Jedynym genem, którego knock - out wykazał podobny efekt w każdym tle genetycznym był gen FOB1. Pozostałe szczepy w różnym stopniu wykazywały zmienność w obrębie tła genetycznego. Określono również rolę tempa wzrostu wielkości komórek w regulacji potencjału reprodukcyjnego. Uzyskane wyniki wskazują na hipertrofię, jako jeden z możliwych czynników regulujących potencjał reprodukcyjny komórek. W znakomitej większości przypadków maksymalna objętość jaką uzyskują mutanty o zwiększonym potencjale reprodukcyjnym jest równa objętości szczepu dzikiego. Świadczy to o wolniejszym tempie przyrostu objętości komórki w przeliczeniu na jedną generację. Podobne objętości uzyskują również mutanty o obniżonym potencjale reprodukcyjnym lub takie, które nie mają wpływu na liczbę generacji. Badania wykazały, że niektóre z analizowanych mutacji prowadzą do osiągania przez komórkę wyższych objętości aniżeli szczep dziki, ale zawsze jest to związane ze zwiększeniem potencjału reprodukcyjnego. Według powszechnie przyjętej interpretacji wyników badań replikacyjnego starzenia drożdży, miarą wieku komórki jest liczba wytworzonych komórek potomnych. W rzeczywistości RLS nie odzwierciedla faktycznej długości życia. Czas życia komórek drożdży to nie tylko czas, w którym wykonuje ona kolejne generacje (faza reprodukcyjna), ale również czas po zakończeniu reprodukcji (faza postreprodukcyjna). Czas trwania reprodukcyjnej fazy życia komórek jest wyznaczony przez dwa parametry: liczbę cykli, tj. potencjał reprodukcyjny oraz czas pojedynczego cyklu. Uzyskane dane wskazują, że oba te parametry mogą działać łącznie bądź też niezależnie, prowadząc do osiągnięcia tego samego efektu, np. mutanty delecyjne fob1 i sfp1 w tle genetycznym szczepu BMA64-1A pomimo znacznych różnic w potencjale reprodukcyjnym mają identyczną reprodukcyjną fazę życia. Po zakończeniu ostatniego cyklu komórkowego komórka nie umiera, ale żyje jeszcze przez pewien czas, którego długość zależy między innymi od czasu podwojenia oraz liczby cykli komórkowych wykonanych przez komórkę ”matkę”. Zwiększenie liczby generacji wykonanych przez komórkę przyczynia się do skrócenia czasu życia po zakończeniu reprodukcji. Może to być związane ze znacznym obciążeniem energetycznym komórki "matki", wynikającym z jednej strony z nakładów ponoszonych na wzrost jej objętości podczas kolejnych cykli, a z drugiej strony z nakładów związanych z reprodukcją, czyli tworzeniem nowych komórek potomnych. Sumując reprodukcyjny i postreprodukcyjny czas życia uzyskujemy wartość całkowitej długości życia, która może być podstawą do stwierdzenia czy mamy do czynienia z długowiecznością, czy też nie. Analiza całkowitej długości życia dostarczyła istotnych danych dotyczących długowieczności, które zmieniają zupełnie wnioski płynące z dotychczasowych badań nad starzeniem z wykorzystaniem drożdży S. cerevisiae. Żaden z analizowanych szczepów określanych w literaturze jako "długowieczne" tak naprawdę nie żyje dłużej od szczepu referencyjnego. Jedynie mutant delecyjny sfp1 , mimo tego, że w literaturze określany jest jako krótko żyjący (na podstawie liczby generacji), po przeanalizowaniu całkowitej długości życia okazał się być jedynym, spośród analizowanych, szczepem długo żyjącym. Próbą wyjaśnienia mechanizmu prowadzącego do długowieczności mutanta sfp1 była analiza parametrów dotyczących bioenergetyki komórki: profil polisomów, inkorporacja [35S]-metioniny in vivo, mikrokalorymetria izotermiczna, oznaczenie zawartości ATP oraz aktywności metabolicznej za pomocą sondy fluorescencyjnej FUN-1. Biorąc pod uwagę teorię tempa życia Pearla, wyniki dotyczące potencjału reprodukcyjnego analizowanych szczepów, czasu podwojenia, czasu trwania fazy reprodukcyjnej i postreprodukcyjnej można wnioskować, że za długowieczność mutanta sfp1Δ może być odpowiedzialne obniżone tempo metabolizmu komórki. Potencjał reprodukcyjny stanowił dotychczas podstawową miarę wieku i długowieczności w badaniach wykorzystujących drożdże jako organizm modelowy gerontologii. Stanowił on również kryterium podziału mutantów na długo i krótko żyjące. Zaprezentowane w tej pracy wyniki przeprowadzonych analiz skłaniają do zmiany sposobu określania długowieczności drożdży, uwzględniając przede wszystkim czas życia, a nie tylko liczbową wartość potencjału reprodukcyjnego komórek.
Yeast Saccharomyces cerevisiae is one of model organisms for research connected with ageing processes. Despite many features typical for this group e.g. the presence of cell wall, closed mitosis, budding as a mechanism of cytokinesis, they are models for research on universal methods of this process. One of the models used in yeast gerontology is co-called replicative life span. It has been assumed that by researching the influence of various factors on RLS value, it will be possible to explain the basic ageing mechanisms, as well as longevity of humans and animals. The study is connected with physical separation of daughter cells from mother cells and counting these newly produced daughter cells with the usage of micromanipulation technique. The measure of age and longevity of yeast cells is a number of daughter cells produced by "mother cell" during lifetime. This way of expressing age does not include cell lifetime. Because of that reason the term replicative lifespan was replaced by the term reproductive potential. This term better describes the essence of research, as well as it also allows a different cause of reduced reproductive capacity of yeast cells than ageing process. The aim of this research was analysis of changes in cells size during the reproductive phase of life, analysis of reproductive potential and cells lifetime of selected mutants, belonging to the group of "long-lived". Taking into consideration the fact that phenotypic effect of the mutations is often dependent on genetic background. Yeast cells representing three different genetic backgrounds were used in that analysis: SP-4, BY4741 and BMA64-1A. Wild strains representing particular genetic backgrounds differ from each other as far as the average and maximum value of reproductive potential is concerned, what can influence phenotypic expression of studied mutations. Three genes FOB1, SCH9, RPL20B were chosen for that analysis and their deletion, according to data in literature, causes increase of reproductive potential. Deletion mutant sfp1 which is considered to be short-lived, was also used. The results concerning reproductive potential indicate that phenotypic effect for most mutants is not identical and dependent on genetic background. The only gene which knock-out showed similar effects in each genetic background was gene FOB1. The remaining strains showed variation within the genetic background in varying degrees. The role of cell volume increase rate in regulation of reproductive potential was determined. The obtained results indicate hypertrophy as one of possible factors regulating cell reproductive potential. In most cases the maximum size which mutants with increased reproductive potential obtain equals the size of wild strains. It is the evidence of slower rate cell volume increase per one generation. Similar volume can be reached by mutants with decreased reproductive potential or those who do not have an influence on number of generations. According to results of the study some of analysed mutations lead to higher volume obtained by a cell than wild strains, but it is always associated with increase of reproductive potential. According to generally accepted interpretation of study results of yeast replicative lifespan, the measure of cell age is a number of produced daughter cells. In reality, RLS does not reflect the real lifespan. Yeast cell lifetime is not only time, when it produces next daughters (reproductive lifespan), but also time after reproduction (postreproductive lifespan). The duration of cells reproductive lifespan is determined by two parameters: number of cycles i.e. reproductive potential and duration of one single cycle. Obtained data show that both parameters can work together or separately, leading to the same result, e.g. deletion mutants fob1 and sfp1 in genetic background of BMA64-1A strain, despite significant differences in reproductive potential, have identical reproductive phase of life. When the last cell cycle is over, the cell does not die, but lives for some time. The duration of this period of time depends among other things on doubling time and a number of cel cycles of "mother cell". Increase of a number of generations, produced by a cell contributes to a shorter life after the process of reproduction. It can be connected with significant energy load of a "mother cell", resulting from effort incurred to increase its volume during next cycles on one hand and efforts connected with reproduction (with production of new daughter cells) on the other hand. Taking reproductive and post reproductive lifetime into account we receive the total lifespan, which can be a basis to state whether we deal with longevity or not. The analysis of total lifespan has provided us with crucial data concerning longevity, which totally change conclusions of previous research on ageing with the usage of yeast S. cerevisiae. None of the analysed strains defined as "long-lived" according to literature, in reality lives no longer than reference strain. Only deletion mutant sfp1, despite the fact that it is defined as ‘short-lived’ according to literature (on the basis of generation number), after the analysis of its total lifespan it turned out to be the only long-lived strain among those analysed. An attempt to explain the mechanism leading to longevity of mutant sfp1 was an analysis of parameters concerning cell bioenergetics: profile of polysomes, in vivo incorporation of [35S]-labeled methionine, isothermal microcalorimetry, indication of content of ATP and metabolic activity with the usage of fluorescent probe FUN-1. Taking into consideration Pearl’s theory of pace of life, conclusions concerning reproductive potential of analysed strains, doubling time, duration of reproductive and post reproductive phase, we can conclude that decreased rate of cell metabolism can be responsible for longevity of mutant sfp1Δ. Reproductive potential was the basic measure of age and longevity during research with yeast as a model organism in gerontology. It was responsible for criterion of dividing mutants into long-lived and short-lived ones. Results of analyses presented in this thesis make us change our mind about determining the longevity of yeast, including particularly lifetime and not only numerical value of cell reproductive potential.
Opis
Słowa kluczowe
drożdże , starzenie , długowieczność , yeast , aging , longevity
Cytowanie